Наразі існує багато методів неклінічного дослідження in vitro та in vivo, а також досвід розробки лікарських засобів, що продаються. Однак передбачити клінічну ефективність і безпеку за допомогою оптимізованих не-клінічних досліджень залишається складним, і ця стаття проводить поглиблений-аналіз цього питання.
Ідеальний АЦП повинен мати принаймні такі три характеристики:
1. Здатність до націлювання: ідеальний цільовий антиген ADC експресується лише на поверхні пухлин і на високих рівнях, без легкого виділення.
2. Процес трансформації: перш ніж досягти клітини-мішені, цитотоксична молекула в ідеалі не повинна виділятися з ADC, тобто весь ADC проникає в клітини.
3. Вивільнення малої молекули токсину: мала молекула повинна швидко та масово вивільнятися всередині пухлинних клітин; мала молекула повинна мати високу токсичність, щоб ефективно вбивати пухлинні клітини.
Стратегія фармакологічної оцінки ADC
Дослідження фармакологічної дії зазвичай проводяться під час відкриття лікарського засобу або фази доклінічної оцінки. Основні експериментальні проекти, які необхідно здійснити, включають активність зв’язування з мішенню, антитіло{1}}опосередковану інтерналізацію, in vivo та in vitro інгібування проліферації пухлини (для проти-пухлинних ADC), антитіло-залежну клітинну цитотоксичність (ADCC) і комплемент-залежну цитотоксичність (CDC).
При дослідженні фармакодинаміки ADC у тварин перш за все враховуються видові відмінності. Якщо ADC не мають зв’язувальної активності або мають низьку активність зв’язування з антигенами у мишей, необхідно розглянути можливість використання трансгенних тварин для фармакодинамічних експериментів або проведення фармакодинамічних досліджень in vivo з антитілами тваринного -походження. Трансгенні тварини можуть уникнути використання альтернативних антитіл, і коли цільовий антиген експресується в кровоносних судинах або стромі хазяїна, трансгенні тварини можуть не тільки оцінити фармакодинамічні ефекти, але й певною мірою спостерігати реакції токсичності. Якщо цільовий антиген експресується лише в пухлинних клітинах людини, немає потреби в трансгенних тваринах; Фармакодинамічні ефекти можна перевірити на моделях голих мишей, імплантованих пухлинними клітинами людини. Під час проведення фармакодинамічних досліджень на клітинному рівні або на рівні тваринної моделі одночасне проведення досліджень ФК/ФД, аналіз розподілу націленого препарату, рівня зайнятості рецепторів і зв’язку між експозицією препарату та ефектом може допомогти в розробці клінічних схем дозування та аналізі результатів дослідження безпеки.
Стратегія токсикологічної оцінки ADC
Вибір видів тварин. Для повного виявлення характеристик токсичності ADC у не-клінічних дослідженнях безпеки для підтримки клінічної розробки ADC оцінка відповідності досліджуваних видів тварин і можливості перекладу результатів не-клінічних досліджень має вирішальне значення. Це визначення зазвичай включає перевірку спорідненості зв’язування ADC з цільовими антигенами у не-клінічних видів порівняно з людьми, а також порівняння спектру імуногістохімічного фарбування в дослідженнях перехресної-реактивності тканин. Ефекторні функції або імуногенність антитіл також можуть відрізнятися через видові відмінності.
Параметри впливу та метаболізм: крім того, як і інші ліки та біологічні продукти, екстраполяція результатів неклінічного дослідження на людей має включати порівняння параметрів впливу та метаболізму. Наприклад, BR-96 є ADC, утвореним ковалентним зв’язуванням доксорубіцину (DOX) із залишками цистеїну гуманізованого моноклонального антитіла BR96 через лінкер гідразиду 6-малеімідохексанової кислоти. Токсикологічні дослідження показали, що, на відміну від щурів і мавп, собаки більш чутливі до токсичних ефектів BR-96, з геморагічним ентеритом як дозолімітуючою токсичністю. Дивно, але BR96-DOX і немодифіковане моноклональне антитіло BR96 мають однакову токсичність, що обмежує дозу, що вказує на те, що токсичність викликається моноклональним антитілом. На відміну від немодифікованого DOX, ADC не індукували кардіоміопатію на моделях щурів. Таким чином, вибір дози для фази I клінічного випробування BR96-Dox на людях базувався на результатах токсикології на собаках.
Цільова експресія антитіл: як і терапевтичні моноклональні антитіла, не-клінічній оцінці ADC може перешкоджати відсутність цільових антигенів у тестових тварин. У рекомендаціях ICH S6 (R1) щодо доклінічної оцінки безпеки біотехнологічних-фармацевтичних препаратів (2011) зазначено: «Вибір видів для кон’югатів антитіла-лікар/токсин (ADC), що містять нові токсини/токсини, має відповідати тим самим загальним принципам, що й для немодифікованих антитіл. Відповідними видами тварин для тестування моноклональних антитіл є ті які експресують потрібний епітоп і демонструють спектр перехресної -реактивності тканин людини, тому специфічність виду та захворювання може визначати або обмежувати не{10}}клінічну оцінку».
Нормальна тканинна експресія цільового антигену є основною проблемою безпеки терапії ADC. В ідеалі цільовий антиген повинен експресуватися на дуже низьких рівнях у нормальних клітинах; однак, як згадувалося у двох наведених вище прикладах, антитіла не завжди специфічні на практиці. Інші приклади потенційної токсичності, пов’язані з недостатньою специфічністю для мішеней ADC, включають NaPi2b, натрій-залежний транспортер фосфату, який експресується в кількох типах пухлин, але також виявляється в нормальних тканинах, де він відіграє роль у гомеостазі неорганічного фосфату. ADC (анти-NaPi2b-vc-MMAE) було розроблено шляхом кон’югації гуманізованого IgG1 анти-NaPi2b моноклонального антитіла до MMAE через пептидний лінкер vc, і було підтверджено його специфічну афінність зв’язування в нормальних тканинах людини та крабовидної мавпи. Однак, незважаючи на високий-рівень експресії в нормальних легенях мавп, безпечність цієї перехресної-реактивності може бути прийнятною, з-обмежувальною дозою токсичністю, не пов’язаною з нормальною тканинною експресією. Токсикологічні ефекти у звичайних щурів, не-зв’язуючих видів і мавп узгоджуються з фармакологією MMAE.
Загальні токсикологічні принципи проектування: загалом немає потреби встановлювати окремі групи для моноклонального антитіла/голого антитіла, лінкера/лінкер-токсину, оскільки молекула моноклонального антитіла є одним із основних факторів, що впливають або визначають системний вплив. Розробка дози повинна враховувати фармакодинамічну дозу ADC, характеристики молекули антитіла та характеристики токсичності маломолекулярного токсину.
Зосередьтеся на токсичності-корисного навантаження:Незважаючи на те, що цілеспрямоване вивільнення низькомолекулярних сполук забезпечує збагачення ліків у цільових тканинах, покращуючи терапевтичне вікно, основні характеристики токсичності ADC все ще подібні до характеристик пов’язаних низькомолекулярних сполук. Більшість реакцій токсичності ADC є менш серйозними, ніж пряме введення маломолекулярних сполук, але деякі ADC можуть посилити реакції токсичності тканин, пов’язані зі зв’язуванням антитіла з мішенню або не{1}}зв’язуванням із мішенню. Хоча ADC збільшують цільове вивільнення низькомолекулярних сполук, деякі низькомолекулярні сполуки все ще передчасно вивільняються, а деякі вільні низькомолекулярні сполуки можуть швидко дифундувати або переходити до навколишніх тканин і системного кровообігу з клітин-мішеней, або апоптоз і пошкодження клітин-мішеней можуть призвести до потрапляння вільних низькомолекулярних сполук у системний кровотік. Частина ADC, що містить антитіла, також може зв’язуватися з іншими не-рецепторами поверхні клітин органів тканини-мішені або епітопами, такими як Fc-рецептор-опосередкований клітинний фагоцитоз, і препарат може чинити токсичну дію на клітини відповідної тканини після метаболічного розпаду. Таким чином, токсичність ADC тісно пов’язана з характеристиками антитіла, низькомолекулярних сполук і лінкерів, і зміни в характеристиках токсичності ADC відбуваються зі зміною антитіла, низькомолекулярних сполук і лінкерів. У не-клінічних дослідженнях безпеки слід приділяти увагу впливу структури складу препарату та фармакокінетичних характеристик на токсичність, а результати експериментів слід всебічно аналізувати.
генотоксичність:Біологічні макромолекули, як правило, безпосередньо не взаємодіють з ДНК, і ADC та його частина антитіла зазвичай не потребують тестів на генотоксичність. Потенційна генотоксичність ADC походить від малих молекул сполук. Якщо низькомолекулярна сполука корисного навантаження є новою сполукою, слід провести тести на генотоксичність; для нових вільних маломолекулярних сполук та/або нових лінкерів, що утворюються в організмі, цільові тестові матеріали слід оцінювати на основі фізико-хімічних властивостей, характеристик розщеплення та структури продуктів розщеплення ADC; якщо достатні дані вказують на генотоксичність досліджуваного матеріалу, дослідження генотоксичності не потрібні.
Репродуктивна токсичність:Маленькі молекулярні сполуки, лінкери та голі антитіла в ADC можуть негативно впливати на репродуктивні органи, фертильність, розвиток ембріона-плоду та розвиток потомства, тому слід звернути увагу на ризик репродуктивної токсичності ADC. Дослідницька стратегія, дизайн експерименту, впровадження та оцінка репродуктивної токсичності ADC мають посилатися на рекомендації ICH S5 і поєднувати механізм дії та цільову популяцію ADC для прийняття конкретної проблеми-стратегії аналізу. ADC, призначені для пацієнтів із пізньою-стадією пухлини, можуть звернутися до рекомендацій ICH S9 щодо дослідження репродуктивної токсичності.
Для біологічних продуктів репродуктивну токсичність зазвичай оцінюють у фармакологічно відповідних видів тварин. Якщо і гризуни, і кролики є цільовими -спорідненими видами тварин, два види тварин слід використовувати для проведення тестів на токсичність ембріо-фетального розвитку, якщо не було підтверджено летальність ембріона або тератогенність для одного виду. Якщо цільовими-зв’язуючими видами тварин є не-людиноподібні примати або немає відповідних видів тварин, щури або кролики зазвичай розглядаються як перші для тестів на репродуктивну токсичність, щоб дослідити репродуктивну токсичність вільних низькомолекулярних сполук. Якщо результати дослідження підтверджують позитивність, немає потреби досліджувати репродуктивну токсичність за допомогою цільових-зв’язуючих видів тварин; в іншому випадку для виявлення антиген-опосередкованої репродуктивної токсичності слід розглянути можливість тестування на не-приматах або трансгенних тваринах або альтернативних молекулах. Якщо антитіло або низькомолекулярна сполука в ADC мають літературні дані, які чітко демонструють потенційні ризики репродуктивної токсичності, дослідження репродуктивної токсичності не потрібні, і відповідний контроль ризику може базуватися на літературній інформації.
Канцерогенність:Виходячи з характеристик ADC, можна розглянути необхідність досліджень канцерогенності відповідно до ICH S1, ICH S6, ICH S9 та інших відповідних рекомендацій.
Імуногенність/імунотоксичність:ADC можуть викликати імуногенність після потрапляння в організм, виробляючи анти{0}}антитіла до ліків. Оцінка імуногенності ADC допомагає проаналізувати результати фармакокінетики, ефективності та безпеки препарату, тому виявлення антитіл до-препаратів зазвичай супроводжується не-клінічними дослідженнями безпеки ADC. Антитіла до -препаратів можуть утворюватися з частини антитіла та лінкерної частини ADC, і необхідність подальшого дослідження епітопів антигену має залежати від ризику імуногенності. Стратегія розробки, валідації та аналітичного виявлення для аналізу імуногенності ADC повинна відповідати «Технічним рекомендаціям щодо дослідження імуногенності лікарських засобів». ADC можуть посилатися на ICH S6, ICH S8, ICH S9 та інші рекомендації та обґрунтовано розробляти індикатори виявлення імунотоксичності на основі таких факторів, як тип і механізм дії ADC. Окрім звичайних досліджень імунотоксичності, за необхідності слід розглянути можливість проведення додаткових досліджень імунотоксичності.
Оптична безпека:Перед фазою I клінічних випробувань потенційна фототоксичність повинна бути попередньо оцінена на основі фотохімічних властивостей і фармакологічних/хімічних категорій сполук з малими молекулами (включаючи лінкери). Якщо ці дані свідчать про потенційні ризики, необхідно вжити відповідних заходів захисту для учасників клінічних випробувань. Якщо не-клінічні дані або клінічний досвід не можуть повністю оцінити ризик фотобезпеки, оцінку фотобезпеки відповідно до принципів, описаних у ICH S10, слід надати перед клінічними випробуваннями великої-вибірки (Фаза III).
Перехресна-реактивність тканин:Дослідження тканинної перехресної -реактивності – це тести на зв’язування з тканинами in vitro, які проводяться за допомогою імуногістохімічних методів для визначення характеристик зв’язування антитіл і епітопів антигенів у тканинах. Дослідження тканинної перехресної -реактивності можуть надати корисну додаткову інформацію для розуміння цільового розподілу, а також можуть надати інформацію про потенційне несподіване зв’язування. Дослідження тканинної перехресної-реактивності з використанням тканин людини є невід’ємною частиною серії початкових клінічних оцінок безпеки дозування препаратів з антитілами. Коли немає пов’язаних із цільовою-зв’язуванням видів тварин, інформація про перехресну-реактивність тканин особливо важлива для прогнозування ризиків токсичності для людини. Для ADC, призначених для виявлення пухлин на пізній-стадії, дослідження тканинної перехресної-реактивності не потрібні, якщо після оцінки токсикологічних ефектів у відповідних видів тварин немає особливих проблем.
Наразі ICH, FDA, NMPA та інші агенції випустили відповідні технічні вказівки для не-клінічних фармакологічних і токсикологічних досліджень ADC. Дослідники можуть розробляти науково обґрунтовані не-клінічні фармакологічні та токсикологічні дослідження на основі характеристик ліків, максимізуючи екстраполяцію фармакодинамічних ефектів і токсичних реакцій на не-клінічному-тваринному рівні на людей, прогнозуючи ефективність і безпеку АЦП у клінічному застосуванні, тим самим підвищуючи рівень успішності клінічних випробувань і знижуючи ризики розвитку. Розробники ліків можуть спілкуватися з регуляторними органами на основі попередніх результатів досліджень і наявних проблем, щоб отримати науково стандартизовану інформацію про підтримку не-клінічних досліджень.
