Генетичні захворювання все ще залишаються глобальною проблемою, оскільки вони викликані мутаціями в генах, які впливають на біологічні функції, метаболічні процеси або виробництво певних основних білків індивідів, аж до різноманітних спадкових розладів. Препарати для генної терапії — це тип терапевтичного втручання, спрямованого на конкретні гени, спрямованого на їх відновлення або модифікацію, а також надання нових інструкцій для клітин щодо виробництва функціональних білків або втручання в дефекти генів, які викликають захворювання.
Звичайні генні препарати в основному включають ДНК і РНК, де ДНК може бути фрагментами генів або генними послідовностями з терапевтичними ефектами. Ці ДНК доставляються в клітини для заміни або доповнення дефектних або відсутніх генних функцій. РНК може бути матричною РНК (мРНК), малою інтерферуючою РНК (міРНК) або антисмисловими олігонуклеотидами (ASO) тощо, які можна використовувати для модифікації, інгібування експресії шкідливих генів або відновлення функції конкретних генів.
Проте як ДНК, так і РНК стикаються з багатьма проблемами від потрапляння в організм людини до досягнення клітин-мішеней. Оскільки генні послідовності є нестабільними в шлунково-кишковому тракті, їх зазвичай вводять шляхом внутрішньовенної або підшкірної ін’єкції, але навіть у цьому випадку більшість генних послідовностей все ще розщеплюються великою кількістю нуклеаз в організмі людини.
Коли невелика кількість залишкових генних препаратів досягає зовнішньої частини клітин-мішеней, вони не можуть потрапити в клітини, оскільки послідовності генів являють собою великі молекули з фосфатними групами, що несуть негативні заряди, тоді як клітинні мембрани також несуть негативні заряди. Коли два негативних заряди зустрічаються, гени відштовхуються і не можуть проникнути в клітини. Тому нам потрібно розробити спеціальні методи доставки генних ліків, щоб запобігти їх деградації in vivo та підвищити ефективність проникнення через клітинну мембрану, а також безперешкодно доставляти послідовності ДНК або РНК до клітин.
Методи доставки генних препаратів
Сучасні поширені методи доставки генів в основному поділяються на дві категорії: доставка вірусним вектором і доставка не{0}}вірусним вектором. Вірусна векторна доставка в основному включає адено-асоційований вірус (AAV) і лентивірус тощо, які можуть імітувати процес зараження вірусом клітин-господарів і легко долати клітинні бар’єри, таким чином досягаючи високої ефективності доставки. Однак доставка вірусного вектора також має проблеми: по-перше, він має обмежену ємність упаковки, наприклад, максимальна ємність упаковки AAV становить 4,7 кб, що не може доставити довші генні послідовності; по-друге, вірусні вектори можуть викликати серйозні імунні реакції, включаючи клітинний імунітет і гуморальний імунітет, створюючи ризик для клінічного застосування. Порівняно з цим, не-вірусні вектори мають величезні переваги щодо безпеки та здатності завантажувати ліки.
Зараз широко використовувані не{0}}вірусні вектори в основному включають ліпосоми, полімери, наночастинки, екзосоми тощо, серед яких ліпосоми — це везикули, утворені амфіфільними молекулами з діаметром від 100 нм до 1 мкм. Вони в основному складаються з фосфоліпідів, холестерину, PEG-ліпідів і катіонних ліпідів. Структура фосфоліпідного подвійного шару подібна до клітинних мембран і може безперешкодно проникати в клітини шляхом ендоцитозу. Крім того, ліпосоми також можуть модифікувати ПЕГ або специфічні антитіла на їхніх поверхнях, щоб уникнути імунного очищення організму, націлюючись на конкретні тканини або клітини. Катіонні ліпосоми - це ліпосоми, які містять позитивно заряджені ліпіди солі четвертинного амонію, які можуть краще зв'язуватися з негативно зарядженими лікарськими засобами нуклеїнових кислот і підтримувати стабільність системи доставки. Таким чином, ліпосоми є одним із поширених не-вірусних векторних методів доставки генних препаратів.
Однак традиційні ліпосоми також мають деякі проблеми: по-перше, через великий діапазон діаметрів ліпосом, хоча це може забезпечити достатню здатність до завантаження ліків, коли ліпосоми проходять через ендотеліальний проміжок судин (100-200 нм), занадто великий розмір перешкоджатиме цьому процесу. Крім того, після того, як ліпосоми потрапляють у клітини шляхом ендоцитозу та формують ендосомно-лізосомну систему, традиційні ліпосоми не можуть вчасно завершити вихід із лізосом, що призводить до того, що більшість генних препаратів розщеплюються лізосомами та не можуть проявляти свою дію. На основі цих недоліків традиційних ліпосом у доставці генних ліків були розроблені ліпідні наночастинки (LNP), які стали важливим методом доставки, особливо придатним для доставки нуклеїнових кислот до цільових клітин і тканин.
Вступ до несучої системи LNP
Ліпідні наночастинки (LNP) – це наночастинки, що складаються з ліпід{0}}подібних речовин із діаметром, як правило, 10–200 нм. Порівняно з традиційними ліпосомами вони менші і легше проходять через ендотеліальні проміжки судин. Крім того, LNP зазвичай складаються з катіонних/іонізованих ліпідів, допоміжних фосфоліпідів, ліпідів поліетиленгліколю (PEG) і холестерину. Серед них допоміжні фосфоліпіди та холестерин можуть підвищувати стабільність LNP; PEG-ліпіди допомагають збільшити час циркуляції LNP in vivo та зменшити імунні реакції. Ці компоненти мають схожі функції з традиційними ліпосомами. Різниця полягає в катіонних/іонізованих ліпідах, які також є основною сферою патентного захисту LNP.
Як згадувалося раніше, катіонні ліпосоми можуть ефективно підтримувати зв'язування з лікарськими засобами нуклеїнових кислот і покращувати ефективність доставки лікарських засобів нуклеїнових кислот. Однак катіонні ліпосоми також схильні до не-специфічного зв’язування з негативно зарядженими білками плазми, клітинами крові тощо в системі кровообігу, що спричиняє агрегацію ліпосом і їх швидке виведення з організму (період напіврозпаду-катіонних ліпосом in vivo становить лише 15 хв).
Щоб вирішити цю проблему, дослідники розробили новий тип ліпідного матеріалу під назвою іонізуючі ліпіди. Іонізуючі ліпіди за структурою дуже схожі на катіонні ліпіди. Взявши як приклад звичайний катіонний ліпід DOTAP та іонізований ліпід DODAP, різниця полягає в тому, що DOTAP є четвертинною амонієвою сіллю з позитивним зарядом, тоді як DODAP є структурою третинного аміну. Структура третинного аміну може підтримувати рКа ліпіду між 6-7. Коли pH нижчий за pKa (у кислих умовах), іонізуючі ліпіди заряджені позитивно.
Коли pH близький до pKa (за нейтральних умов), іонізуючі ліпіди є нейтральними. Ця конструкція може розумно вирішити проблему, з якою стикаються катіонні ліпосоми: оскільки рН у кровообігу близький до нейтрального, іонізуючі ліпіди також є нейтральними, і не-специфічний зв’язок між ними та білками плазми або клітинами крові значно зменшується, подовжуючи-період напіврозпаду. Крім того, коли іонізовані ліпідні LNP поглинаються клітинами та потрапляють у лізосоми, ліпіди іонізуються та позитивно заряджаються в лізосомальному середовищі з pH 5-6. Позитивно заряджені ліпіди легко зливаються з ендосомно-лізосомною мембраною, дозволяючи ліпосомам виходити в цитоплазму, дисоціювати та вивільняти нуклеїнові кислоти, таким чином проявляючи свою дію. Підводячи підсумок, розробка системи носія LNP передбачає оптимізацію ліпідного складу, розміру частинок, поверхневого заряду та стабільності для досягнення ефективної доставки генів.
Стратегія біоаналізу LCMS для LNP-упакованих генних препаратів
Упаковані генні препарати LNP- переважно складаються з оболонки LNP і самого генного препарату. Оболонка LNP в основному складається з ліпідних компонентів (на катіонні/іонізуючі ліпіди припадає близько 30-50%, на ліпіди PEG припадає близько 2%, на холестерин припадає близько 20-50%, на допоміжні фосфоліпіди припадає близько 10-20%), тоді як генні препарати в основному складаються з фрагментів генної послідовності (ДНК, ASO, siRNA та miRNA тощо). Згідно з останніми нормативними документами NMPA та FDA [14-15], для застосування IND препаратів системи доставки ліків, таких як LNP, окрім проведення фармакологічних та фармакокінетичних досліджень активного інгредієнта (послідовності гена), безпеки та фармацевтична оцінка також необхідні для нових ліпідних компонентів, які не використовувалися в ринкових препаратах у системі доставки ліків, таких як катіонні/іонізуючі ліпіди та ліпіди ПЕГ зі спеціальним модифікації в ЛНП.
Біоаналіз LCMS ліпідів LNP зосереджується на катіонних/іонізованих ліпідах і ліпідах PEG. Через структурні відмінності між ними молекулярна маса катіонних/іонізованих ліпідів зазвичай знаходиться в межах 1 кДа, тоді як молекулярна маса ліпідів ПЕГ може досягати 2~5 кДа після перенесення груп модифікації, що призводить до великих відмінностей у хроматографічному утримуванні та реакції мас-спектрометрії між ними. Враховуючи, що вміст катіонного/іонізованого ліпіду в LNP вищий, ніж у PEG-ліпіду, різниця у відгуках призводить до неможливості ефективно уніфікувати методи попередньої обробки (вибір екстракційного розчинника, визначення коефіцієнта розведення) обох. Крім того, через наявність багатьох заважаючих піків навколо положення піку ліпіду ПЕГ, для ефективного розділення часто потрібен довший градієнт поділу рідкої фази, що не може гарантувати високу ефективність аналізу. Тому ми окремо встановлюємо метод визначення ліпідів ПЕГ у біоаналізі. У той же час катіонний/іонізуючий ліпід і ліпід ПЕГ також мають загальні труднощі в розробці методу через їхні ліпідні компоненти, такі як погана розчинність у воді, нестабільність у біологічній матриці, зв’язування з білком для відновлення, що перевищує ліміт, високі перешкоди та залишок ліпіду ПЕГ, зміна стабільності ліпіду в реальній матриці зразка та труднощі у виборі внутрішнього стандарту.
